Gibbs é um ex-fuzileiro e atirador-de-elite da Marinha dos Estados Unidos da América e é o líder da equipe de investigação. Possui comando, não hesita em ser violento quando necessário, é respeitado e querido por todos, mas não deixa a vida pessoal de lado, faz piadas, conversa, flerta, enfim, uma pessoa normal. Gibbs também já foi casado quatro vezes e é atraído por ruivas. Quase ninguém sabe, mas ele já foi casado uma quarta vez, mas recusa-se falar sobre este, pois a sua mulher Shannon Gibbs (Aviva Farber em 2008 e 2010) e a sua única filha foram assassinadas.
Na série, é chamado de Tony, exceto por Gibbs, que o chama pelo sobrenome. É um galã, mas que passa às vezes por grandes apuros, o que vai contra a máxima de que galãs só se dão bem. A experiência como policial de rua ajuda nas suas investigações. DiNozzo sabe tudo sobre filmes e vive comentando sobre filmes parecidos com as situações que eles estão vivendo na investigação. É considerado o "palhaço da classe".
Israelita, filha do diretor da Mossad e meia-irmã do terrorista que matou a agente Kate, surgiu em alguns episódios como colaboradora, mas logo foi agregada à equipe. Ziva é a mais truculenta da equipe, protagonizando cenas de extrema violência, alternando-as com outras bem cômicas, como seu talento para a direção e falhas no idioma inglês. Diz ser apenas "colega" de Tony mas a verdade é que eles têm sentimentos bem mais profundos...
Kate é recrutada pra trabalhar em NCIS no primeiro episódio da série. Tem um bom relacionamento com a equipe. É morta por Ari no final da segunda temporada, chocando a todos principalmente Gibbs, e é substituída por Ziva David.
É um agente de campo, não muito afoito e o mais inexperiente da equipe, sendo chamado de "novato". Em compensação, por ser um ex-acadêmico do MIT (especialista em processamento de dados e afins), seus talentos compensam em outros departamentos. Além de agente NCIS, ele também é escritor e ganha um bom dinheiro com isso. Apesar de ser um "nerd", ele se dá bem com as mulheres
Abby é talvez a personagem mais inverossímil da trama, mas com certeza é a mais carismática. Ela é uma cientista forense e é especialista em informática, genética, química, e quaisquer coisas que forem necessárias. Ela é cheia de tatuagens, viciada em cafeína, e quase não sai de seu laboratório.
É o legista da equipe, um escocês com manias estranhas, e com um carro maravilhoso, com o volante do lado direito, está sempre pronto para jogar conversa fora. No decorrer dos episódios, mostra-se um grande médico, e é uma das poucas pessoas que podem ser chamadas de "amigos" de Gibbs. Ele é ajudado a partir da segunda temporada pelo auxiliar
Jimmy Palmer (
Brian Dietzen).
é o auxiliar do legista desde o final da primeira temporada e é interpretado por Brian Dietzen. Embora normalmente creditado em um papel recorrente, Dietzen foi creditado como "estrelando" desde sexta temporada. Jimmy, referido por Tony como "Autopsy Gremlin", tem diabetes, as vezes é muito atrapalhado.
